Периодическое и непрерывное культивирование микроорганизмов

История питательных сред
Принцип действия и классификация
Жидкие питательные среды
Уреаплазма-50
Микоплазма-50
Микоплазма-АЧ-12
Уреаплазма-АЧ-12
Плотные питательные среды

Особенности периодического культивирования

Различают два основных способа культивирования микроорганизмов — периодическое и непрерывное. При периодическом культивировании клетки помещают в закрытый сосуд определенного объема, содержащий питательную среду, и задают начальные условия. Развитие культуры приводит к постепенной смене условий существования микроорганизмов: увеличивается плотность популяции, снижается концентрация питательных веществ и накапливаются продукты обмена. Периодическую культуру можно рассматривать как замкнутую систему, которая проходит разные фазы своей жизни (рис. 5.5, а).

Рис. 5.5. Типичные кривые роста:

а — при периодическом культивировании; б — диауксия на среде, содержащей два доступных питательных субстрата

Каждая фаза характеризуется определенными физиологическими параметрами. Лаг-фаза — это фаза «привыкания» клеток к среде, при этом происходят увеличение количества ДНК и РНК и индукция синтеза соответствующих ферментов. Лаг-фаза удлиняется, если брать старый посевной материал и переносить клетки в совершенно новую по составу среду. Лаг-фаза сокращается (или может совсем отсутствовать), если активные молодые клетки перенести в свежую среду того же состава и той же температуры. На средах, содержащих смесь субстратов, наблюдается диа- уксия, при которой после исчерпания одного субстрата культура переходит во вторую лаг-фазу для подготовки к потреблению другого субстрата (рис. 5.5, б). В экспоненциальной (логарифмической) фазе клетки растут и делятся с максимальной скоростью, их рост не ограничен. Обычно такие клетки используют в биохимических и физиологических исследованиях. По мере исчерпания субстратов и накопления продуктов обмена скорость роста снижается (наступает фаза замедления роста) и культура переходит в стационарную фазу, в течение которой процессы деления и отмирания клеток в популяции находятся в динамическом равновесии, когда процессы деления и отмирания клеток в популяции уравновешены. Для бактерий эта фаза достигается при концентрации в среднем 109 клеток/мл, для водорослей и простейших — 106 клеток/мл. Когда исчерпание питательных веществ и накопление продуктов метаболизма достигают неких пороговых концентраций, начинается фаза отмирания и число клеток в популяции постепенно снижается. Фаза отмирания обычно тоже имеет логарифмический характер.

Для проведения расчетов р принимались некоторые допущения, при которых скорость изменения плотности клеток в саморазмножающейся системе пропорциональна самой плотности, т.е. изменение в экспоненциальной фазе роста следует кинетике реакций первого порядка. Тогда

Плотные питательные среды

Механизм действия плотных сред также заключается во взаимодействии высокоспецифичных ферментов бактерий с хромогенным субстратом, играющим роль индикатора. Однако если ранее продукты ферментации субстрата были водорастворимы, что изменяло окраску всей среды, то в данном случае они не растворимы, и изменяется только цвет колоний микроорганизмов.

Плотные хромогенные питательные среды имеют значительные преимущества. Во-первых, идентификация возбудителя происходит одновременно с его выделением и не требует проведения предварительных посевов с целью получения чистой культуры. Во-вторых, можно оценить спектр патогенов в пробе и их относительное количество. В-третьих, требования к селективности ниже, что позволяет идентифицировать на них широкий спектр микроорганизмов, принадлежащих к разным родам и видам.

Какой же принцип действия среды?

Сульфид натрия и фуксин, присутствующие в ее составе, способствует образованию реактива Шиффа. То есть сульфид натрия будет обесцвечивать фуксин. В результате этой реакции образуется фуксинсернистая кислота.

Всем известно, что колонии энтеробактерий способны сбраживать лактозу, в ходе этой реакции образуется муравьиная кислота. Из курса химии известно, что муравьиная кислота взаимодействует с альдегидами и дает качественную реакцию. Благодаря этому колонии энтеробактерий будут окрашиваться в розовато-малиновый цвет. Другие грамположительные бактерии (кроме энтеробактерий) не могут сбраживать лактозу, поэтому и окрашиваться они не будут.

В итоге на чашке Петри со средой Эндо, которая имеет розоватый цвет, будут выделяться лишь энтеробактерии в виде палочек малинового цвета. Все остальные колонии будут либо уничтожены, либо не будут выделяться на фоне питательной среды.

Читайте также:  12 способов укрепить иммунитет в домашних условиях

Берем пробу

Мы выращивали микробиом глаза, поэтому использовали инокуляционную петлю для мазка — если вам к себе (или кому-то еще) под веки лезть не очень хочется, можете просто опустить в чашку Петри палец, тогда вы занесете туда всех микробов, что на нем живут.

Инокуляционная петля выглядит вот так

Nadine90 / wikimedia commons / CC BY-SA 3.0

Поделиться

Берем пробу
  1. Возьмите стерильную инокуляционную петлю. Пластиковые продаются уже простерилизованными. Если у вас петля металлическая, то сначала прокалите ее докрасна в пламени, остудите касанием среды и сразу берите мазок. Мы брали мазок из глаза, носа и рта главного редактора N + 1 пластиковой петлей. Мы были осторожны, он не пострадал.
  2. После мазка нанесите длинный штрих петлей на поверхность чашки Петри без нажатия.
  3. Теперь закройте чашку и переверните средой вверх. Чашка всегда должна находиться перевернутой — то есть твердой средой вверх, чтобы капли конденсата не падали на ее поверхность. Для уменьшения высыхания можно также попробовать герметизировать края чашки, но так, чтобы минимальный обмен воздуха сохранился.
Берем пробу

Важно: От открытия до закрытия чашки все действия следует производить строго в «антибактериальной зоне» горелки, чтобы в чашку не осели ненужные нам бактерии.

Берем пробу

Теперь осталось только дождаться, пока бактерии размножатся. В чашке надо воспроизвести температуру, близкую к температуре тела. Чем теплее, тем быстрее будет рост. Тут вам пригодится батарея.

Берем пробу

Чтобы выросли крупные колонии, нужно примерно от двух до четырех дней, но уже на первые сутки вы, скорее всего, уже сможете разглядеть небольшие слизистые комочки на поверхности чашки.

Берем пробу

О предосторожностях Мы работали в холодной и хорошо проветриваемой комнате, в которой бактериям было нечего есть. Также мы стерилизовали все инструменты и перчатки, в которых работали, спиртом. Чтобы удостовериться в том, что все в порядке, мы использовали отрицательные контроли: один из секторов чашки Петри был оставлен пустым, а другой засеян «пустым» шпателем. В результате они остались чистыми, в них ничего не выросло. А значит мы можем с чистой совестью утверждать, что все, что у нас выросло, действительно когда-то обитало в глазу. Поделиться

Берем пробу