Генетический анализ эмбриона: когда, зачем и как проводится

« Отделение генетики Клинического госпиталя на Яузе располагает возможностями для проведения широкого спектра исследований в области репродуктивной генетики, в том числе различных вариантов преимплантационной генетической диагностики».

Биологические функции генов семейства RAS

Одно из ключевых свойств любой опухоли — это нарушение баланса между клеточным делением, т.е. размножением клеток, и клеточной гибелью. Для того, чтобы процесс деления осуществлялся в норме, необходимо поступление верного сигнала в клеточное ядро. Подобным сигналом являются специальные белки – факторы роста. Они прикрепляются к определённым рецепторам на поверхности клеточной оболочки и запускают внутри клетки ряд последовательных биохимических реакций. Результатом становится производство и накопление внутри клетки белков, которые необходимы для дальнейшего деления.

Гены семейства RAS (KRAS, NRAS и HRAS) – это один из важнейших звеньев сигнальной цепочки внутри клетки. Они передают сигналы к делению от рецепторов к ядру клетки. В норме эта цепочка сигналов (или, по-другому, сигнальный каскад) запускается «по команде» факторов роста. Например, фактором роста может выступать белок EGF (Epidermal Growth Factor ‒ перевод «эпидермальный фактор роста»). EGF и другие белки способны стимулировать рост и деление различных клеток. В случае мутации в каком-либо из генов – KRAS, NRAS или HRAS – происходит самопроизвольная активация передачи импульса к делению, то есть клетки начинают размножаться без команды от фактора роста. Процесс выходит из-под контроля, и опухоль начинает активно расти.

Необходимо отметить, что активирующие мутации не только в этих генах, но и в других звеньях сигнальной цепочки могут приводить к постоянной стимуляции клеточного деления. К таким событиям относятся, например, мутации в генах EGFR, BRAF и др. Упомянутые генетические повреждения в разной степени свойственны опухолям различных органов. Например, мутации в генах семейства RAS (KRAS, NRAS, HRAS) встречаются при раке поджелудочной железы, толстой кишки, лёгкого, кожи и т.д. Мутации EGFR характерны для немелкоклеточного рака легкого, а повреждения BRAF с наибольшей частотой обнаруживаются при меланоме.

Сначала были химеры

Первые попытки создания методов редактирования сложных геномов связаны с конструированием «искусственных ферментов» в виде олигонуклеотидов (коротких нуклеотидных последовательностей), которые могли бы избирательно связываться с определенными последовательностями в структуре целевой ДНК и несли бы на себе химические группы, способные расщеплять ДНК (Кнорре, Власов, 1985). Однако до сих пор эффективных методов расщепления ДНК на такой основе создать не удалось.

Реально работающим подходом оказалось конструирование химерных нуклеаз – сложных белков, содержащих две структурные единицы, одна из которых катализирует расщепление ДНК, а вторая способна избирательно связываться с определенными нуклеотидными последовательностями в составе целевой молекулы, направляя на этот участок действие нуклеазы. Подобные химерные нуклеазы можно «производить» непосредственно в клетке: для этого в нее вносят соответствующие генно-инженерные конструкции (векторы), кодирующие нуклеазы. Такие векторы снабжаются сигналом ядерной локализации – белковой структурой, обеспечивающей поступление конструкции в ядро клетки к геномной ДНК.

Первыми среди химерных нуклеаз стали zinc-finger нуклеазы, в состав которых в качестве адресующих структур входят так называемые «цинковые пальцы». Последние представляют собой белковые домены (достаточно стабильные и независимые элементы третичной структуры белка), содержащие молекулу цинка и по форме действительно напоминающие палец (Kim et al., 1996). Каждый «цинковый палец» способен «узнать» и специфично связаться с определенной последовательностью ДНК из трех нуклеотидов.

Читайте также:  Как правильно и не больно сделать укол подкожно

Нужно сказать, что домены «цинковые пальцы» встречаются в составе человеческих факторов транскрипции – белков, регулирующих процесс синтеза РНК с матрицей ДНК. При создании искусственных нуклеаз можно сконструировать цепочку из «цинковых пальцев» так, что она будет узнавать определенный участок ДНК. Если такая цепочка будет достаточно длинной, она может распознавать относительно протяженные последовательности ДНК, состоящие из ряда тринуклеотидных фрагментов. Это означает реальную возможность точечного воздействия на заданные участки в составе больших сложных геномов.

Однако у метода «цинковых пальцев» обнаружились и серьезные недостатки: во-первых, это не вполне строгое распознавание тринуклеотидных повторов, что приводит к заметному числу расщеплений ДНК в «нецелевых» участках. Во-вторых, метод оказался весьма трудозатратным и дорогостоящим, поскольку для каждой последовательности ДНК необходимо создать свою оптимизированную белковую структуру zinc-finger нуклеазы. Поэтому система «цинковые пальцы» широкого распространения не получила.

Более перспективным средством избирательного воздействия на ДНК оказались конструкции на основе химерных нуклеаз, названные TALENs (от Transcription Activator-like Effector Nucleases) (Sanjana et al., 2012). Роль ДНК-распознающих структур в них играют белковые домены, каждый из которых «узнает» только один нуклеотид. Природным прототипом таких доменов явились белки (TAL-effectors) некоторых бактерий, паразитирующих в клетках сельскохозяйственных растений. Эти бактериальные белки, попадая в ядро растительной клетки, имитируют транскрипционные факторы и связываются с определенными участками ДНК, активируя таким образом гены, необходимые для выживания паразита.

Поскольку механизм «узнавания» ДНК в данном случае однозначен и прост (один нуклеотид распознается одним белковым доменом), то получение конструкции, специфично распознающей нужную исследователю нуклеотидную последовательность, – относительно простая задача. Соединяя такую направляющую конструкцию с ферментом, расщепляющим ДНК (как правило, для этих целей используется FokI – каталитический домен фермента рестрикции), мы получаем систему с высокой специфичностью действия.

Здесь нужно отметить, что для успешного разрезания молекулы ДНК с помощью FokI необходимо две субъедини­цы этого фермента. Поэтому все химерные нуклеазы, в составе которых имеется FokI, работают парами: каждая из них узнает свой специфический участок на разных цепочках молекулы ДНК. Эти целевые сайты выбираются так, чтобы они находились на небольшом (10—20 нуклеотидов) расстоянии, достаточном для димеризации доменов FokI, в результате которой формируется каталитически активная структура. Поскольку каждый из блоков такой бинарной нуклеазы связывается с ДНК независимо, точность расщепления ДНК повышается, а воздействие на «нецелевые» последовательности минимизируется.

Перечень проводимых исследований

На сегодняшний день центр молекулярной генетики при клиническом госпитале на Яузе располагает возможностями для проведения обширного перечня генетических исследований:

  • Преимплатационный генетический скрининг. Данный анализ проводится пациентам, прибегнувшим к экстракорпоральному оплодотворению (ЭКО). Он позволяет выявлять эмбрионов, имеющих какие-либо генетические отклонения по всем 24 хромосомам. Благодаря этому, появляется возможность отбирать для имплантации только генетически полноценные эмбрионы, что существенно увеличивает результативность программ ВРТ и значительно повышает шансы на нормальное протекание беременности и рождение здоровых детей.
  • Преимплантационная диагностика моногенных наследственных заболеваний (определяющихся одним геном). У супругов-носителей моногенного генетического заболевания существует высокий риск рождения больного ребенка. При обнаружении совпадения генных мутаций у супругов в результате скрининга на генетическую совместимость или при наличии в семье родственника с известным генетическим синдромом, необходимо проводить преимплантационную диагностику для предотвращения рождения больного ребенка.
  • Генетическая диагностика причин нарушения развития беременности по исследованию частиц хориона при неразвивающейся (замершей) беременности. Подтверждение или исключение генетической патологии у плода позволяет правильно составить тактику дальнейшего обследования будущих родителей, своевременно провести комплекс диагностических мероприятий и вовремя назначить необходимое лечение для достижения главной цели — рождения здорового ребенка в будущей беременности.
  • FISH спермы (флуоресцентная гибридизация in situ). Проводится с целью определить хромосомный статус отдельных сперматозоидов в случае плохих показателей спермограммы.
  • Диагностика рецептивности эндометрия (тест ERA). Лаборатория генетики нарушений репродукции проводит данное исследование с целью определить степень готовности эндометрия матки к имплантации эмбриона. Причинами неудачных попыток ЭКО зачастую становится несовпадение времени, наиболее благоприятного для имплантации, со степенью зрелости и готовностью эмбриона. Перенос полноценных эмбрионов с учетом рецептивности эндометрия существенно повышает шансы наступления беременности.
  • Неинвазивный пренатальный генетический тест (NACE). Дает возможность спрогнозировать течение беременности и определить анеуплоидии по 21, 18 и 13 хромосомам. Расширенный вариант анализа также позволяет определить анеуплоидии 9 и 16 хромосом, которые зачастую являются причиной выкидышей. Помимо этого, тест позволяет обнаружить делеции хромосомного материала, которые могут приводить к развитию генетических синдромов.
  • Тест на генетическую совместимость супругов. Наш центр молекулярной генетики проводит данный тест на этапе планирования беременности. Исследование позволяет произвести высокоточный скрининг известных полиморфизмов и мутаций (40000 вариантов, 549 генов), ответственных за развитие более 600 генетических заболеваний, выявить их носительство и возможное совпадение у супругов, чтобы предупредить их передачу потомству.
  • «Генетический паспорт» — комплекс диагностических мероприятий, направленных на определение вероятности развития наследственных заболеваний, в том числе онкологии.

В своей работе специалисты генетической лаборатории Клинического госпиталя на Яузе используют опыт международных партнеров, в том числе компании Igenomix (Испания).

Как проходит генетический анализ эмбриона при ЭКО

В современных лабораториях предимплантационный генетический анализ эмбрионов включает в себя биопсию и анализ ДНК. Чтобы исследовать зародыш, необходимо сделать забор его клетки. Обычно эту процедуру проводят на третий день после оплодотворения, когда клеток зародыша около восьми. Однако в последнее время многие клиники делают биопсию на пятый день, когда эмбрион состоит уже из ста клеток, и тогда для исследования берут более одной клетки (обычно до пяти).

Такая поздняя диагностика позволяет более комплексно исследовать ДНК будущего ребенка.

Но поскольку эмбрионы культивируют (выращивают в искусственной среде) не более пяти дней, то врачи прибегают к их заморозке, пока не будут готовы результаты тестов.

Когда проводится генетическое исследование материала взрослого человека, для врачей доступны миллионы клеток. Благодаря этому, тест получается надежным и достоверным. Когда же речь идет об одной или, в лучшем случае, пяти клетках маленького эмбриона, вероятность ошибки очень высока: появление случайной ДНК может стать причиной возникновения ошибки в исследовании. Поэтому в большинстве медицинских центров проводится анализ ДНК родителей, чтобы определить их набор хромосом в клетке эмбриона.

Как проходит ПГД эмбриона в клинике NGC в Москве?

В клинике NGC преимплантационное генетическое тестирование проводится методом NGS. На данный момент в генетической лаборатории клиники проанализировано более 20 000 эмбрионов.

ПГТ в клинике NGC проводится в несколько этапов:

1. Биопсия эмбрионов. Анализ проводится на 5, 6 или 7 сутки развития эмбриона, который называется бластоцистой. Для исследования эмбриологи отбирают наиболее жизнеспособные эмбрионы и проводят у них забор клеток. На этой стадии бластоциста уже имеет около 200 клеток. Из них 5―8 можно взять на генетический анализ, не причиняя эмбриону вреда. Биопсия клеток выполняется при помощи высокоточных лазеров. Затем эмбрион криоконсервируется (замораживается), а взятые на анализ клетки помещаются в пробирку со специальным раствором и отправляются в генетическую лабораторию.

Читайте также:  Диагноз олигоастенотератозооспермия : причины и лечение

2. Выделение ДНК и полноэкзомное секвенирование. Выделение ДНК из клеток проводится лабораторным генетиком в несколько этапов с помощью множества химических реакций. Затем полученный материал загружается в секвенатор (аппарат для умножения и считывания ДНК). В клинике NGC используется секвенатор нового поколения MiSeqDx компании Illumina, USA.

3. Биоинформатический анализ Лабораторный генетик проводит анализ полученных данных секвенирования, где оценивается количество и генетический материал каждой хромосомы.

4. Медико-генетическое консультирование. Врач-генетик составляет заключение для каждого эмбриона, где отражаются прогнозы наступления беременности, развития плода и ребенка с рекомендацией относительно переноса.

5. Перенос эмбрионов. Эмбрионы, прошедшие проверку и рекомендованные к переносу, переносятся в полость матки женщины в криопротоколе. Эмбрионы, прошедшие ПГТ, имеют высокий потенциал наступления беременности (70―72%), поэтому переносят, как правило, один.

Мы настоятельно рекомендуем не экономить на генетическом анализе. Проведя полное обследование, вы будете уверены, что ваш ребенок родится здоровым, а это самое главное для каждого родителя.

Кому это нужно?

Тем, у кого развилась резистентность опухоли или непереносимость ко всем препаратам из стандартного протокола лечения. Ситуация, когда «все перепробовали — не помогло».

В принципе, нынешние стандарты лечения, особенно европейские и американские протоколы (NCCN), которые мы применяем в «Медицине 24/7», обладают хорошим терапевтическим потенциалом — не зря они считаются «золотым стандартом» лечения в онкологии.

По этим стандартам, сначала назначают препараты 1-й линии терапии — те, что статистически лучше всего помогают при данном диагнозе. Смотрят динамику. Если опухоль не реагирует на лечение или — что хуже — прогрессирует — переходят к препаратам 2-й линии — тем, что по результатам исследований давали чуть менее успешное лечение. Если эти препараты тоже перестают помогать — идем к 3-й линии, и т. д. Многим пациентам длины этой «цепи» хватает до конца жизни.

Но регулярно, к сожалению, врачи оказываются в тупике: в ситуации, когда все линии «протокольной» терапии закончились, а пациент жив и прогрессирует. Коварство раковых опухолей — в их изменчивости. Они очень быстро мутируют дальше, и приспосабливаются к любым условиям, к любым препаратам. Для пациента это означает развитие резистентности — все препараты, прописанные в протоколах лечения, перестали действовать на его опухоль.

Нужно продолжать лечение — а у врача закончились «инструменты», предписанные официальными стандартами лечения. Есть другие препараты, есть право назначить их off-label, вне стандартных линий терапии. Но как узнать, какое лекарство выбрать?

В этом случае молекулярно-генетическое исследование и дает нам понимание, какой препарат будет эффективен против данной опухоли, именно с этим набором мутаций. Назначение такого препарата позволяет выиграть главный для онкопациента ресурс — время.